鴨圓環病毒ORF3基因的序列分析及基因表達.pdf

1、鴨圓環病毒(DuCV)屬于圓環病毒科圓環病毒屬，可導致鴨的免疫抑制，對養鴨業造成危害。本研究通過DuCV ORF3的片段大小對DuCV進行了基因型分類，并通過原核表達和真核表達對ORF3的功能進行了研究。主要內容如下：
　　 ⑴鴨圓環病毒ORF3基因克隆測序及序列分析。為了解DuCV不同分離株的ORF3基因變異情況以及分析它們的同源性，本研究從臨床病料中對DuCV的ORF3基因進行了克隆測序，結果獲得了10株DuCV的ORF3基

2、因序列，并與GenBank登錄的45株DuCV的ORF3基因進行同源性分析，結果表明所有DuCV的ORF3基因根據大小及同源性差異分為兩個基因型：基因1型和基因2型。同一基因型之間的核苷酸同源性為95.8％～100％，氨基酸同源性為88.6％～100％，而不同基因型之間的核苷酸同源性僅為87.8％～91.6％，氨基酸同源性僅為72.2％～81.0％。55個毒株中的36個屬于基因1型，ORF3基因大小為237bp，編碼78個氨基酸的蛋白；

3、19個毒株屬于基因2型，ORF3基因大小為297bp，編碼98個氨基酸的蛋白。本研究獲得的10株DuCV的ORF3基因9株屬于基因1型，1株屬于基因2型，說明當前我國流行的DuCV主要為ORF3基因1型。
　　 ⑵鴨圓環病毒FJ0601株ORF3蛋白的原核表達及其抗血清制備。本研究采用PCR方法擴增出DuCV FJ0601株ORF3基因，將其克隆入原核表達載體pET-32a(+)中，構建了DuCV ORF3基因的原核表達質粒pE

4、T-32a-ORF3，將其轉入宿主菌Rosetta(DE3)Plys中進行誘導表達。SDS-PAGE電泳結果表明DuCV ORF3蛋白在大腸桿菌中得到了高效表達，Western-blotting檢測結果顯示，該蛋白作為抗原可以與DuCV的陽性血清發生抗原抗體反應，從而首次證實了DuCV的ORF3為功能性基因，在DuCV感染宿主過程中進行了表達。將原核表達的蛋白純化后免疫小鼠，制備了抗DuCV ORF3蛋白的血清，為后續研究奠定了基礎。<

5、br>　　 ⑶DuCV ORF3基因的真核表達。采用PCR方法擴增出DuCV FJ0601株的ORF3完整基因，并將其克隆到Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統的桿狀病毒轉移載體pFastBacHT B中，獲得重組轉移載體pFast-ORF3，再將其轉化DH10Bac感受態細胞，發生轉座作用，通過藍白斑篩選獲得含有ORF3基因的重組桿狀病毒DNA，以脂質體介導法將重組桿狀病毒DNA轉染Sf9昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒Bacmid-OR