2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、臨床研究及實驗表明,基因治療的關鍵在于載體的選擇。發展至今,不同時期已有多種不同的載體應用于基因治療中,如逆轉錄病毒載體、單純皰疹病毒載體、慢病毒載體、腺病毒及腺相關病毒載體等。各種載體都具有各自的優點及缺陷。腺病毒載體的結構及功能研究較為清楚,因其致病原性低,宿主范圍廣泛,包裝生產簡單,可同時表達多個基因等優勢在基因治療中被廣泛應用;但是腺病毒同樣存在靶向性差,表達外源基因時間短,容易引起較為強烈的免疫反應等諸多缺陷。
  

2、目前國際上較為公認的腺相關病毒(AAV)載體可以在一定程度上彌補這些不足。AAV對人體免疫原性低,幾乎無致病性,可介導目的基因長效表達,并且宿主范圍極為廣泛,能感染不同細胞周期的多種類型細胞。己發現的AAV血清型至少有150多種,不同血清型的AAV可以靶向不同的細胞和組織,進一步擴大了AAV的應用范圍。
   AAV1因其可以高效靶向骨骼肌,攜帶外源基因應用于臨床研究和治療更為安全,已經越來越多的被作為基因治療載體用于多種疾病的

3、治療。但是臨床研究對AAV1的需求量極高,一般滴度要達到1017VG/ml。傳統的質粒轉染生產方式所得到的AAV容易被腺病毒污染,并且耗時耗力,過程繁瑣,實際操作很難達到臨床需要的用量。
   本研究采用二桿狀病毒-昆蟲細胞生產系統,期望探索出一套rAAV1規?;b生產的穩定方法。桿狀病毒能夠為Aav的復制包裝提供必要的輔助元件,并且桿狀病毒不會像腺病毒和單純皰疹病毒一樣對人體產生毒性,又借助對昆蟲細胞Sf9的感染性,在昆蟲細

4、胞中懸浮生產重組AAV載體,是一種較為理想且能滿足臨床需求的新型重組AAV生產方式。
   本研究首先構建完成了三個攜帶了AAV包裝所需的順式和反式作用元件的重組pFastBacDual質粒:pFBD-AAV1RepiCapi和pFBD-AAV1RFP、pFBD-AAV1AT7(Avastin):利用重組pFastBacDual質粒轉化DH10TMBac感受態菌株,獲得Bac-AAV1RepiCapi和Bac-AAV1RFP、B

5、ac-AAV1AT7(Avastin),滴度分別為5.42×108 VG/ml、2.63×108VG/ml、5.95×1012VG/ml;采取二桿狀病毒系統成功包裝出重組AAV病毒rAAVlRFP、rAAV1-AT7(Avastin),rAAV1-RFP。100ml錐形瓶中包裝出的rAAV1-RFP病毒產量為3.7×1013vg,可達35TU/Cell,生產能力較強;利用rAAV1-RFP感染細胞,熒光顯微鏡下觀察紅色熒光效果理想;運用

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