轉錄因子Twist 1在PPARγ介導的脂肪細胞胰島素抵抗中的作用研究.pdf

1、研究目的:
　　流行病學研究表明，胰島素抵抗(IR)與糖尿病、高血壓、肥胖癥等多種代謝性疾病密切相關，是疾病發生的“共同土壤”。本課題旨在探討轉錄因子Twist1在脂肪細胞胰島素抵抗中的表達水平、對胰島素敏感性的影響以及其與過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)的調控關系，明確Twist1基因在PPARγ介導的脂肪細胞胰島素抵抗中的作用，為胰島素抵抗相關疾病的預防和治療提供相應靶點。
　　研究方法:
　　1.臨床標

2、本收集:選擇2016-2017年在山東省千佛山醫院進行擇期手術的患者，按照體重指數(BMI)和胰島素抵抗指數(HOMA-IR)將研究對象分為對照組和肥胖型IR組。術中收取患者皮下脂肪組織，提取脂肪組織中的RNA，熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)技術分析轉錄因子TWIST1和PPARγ的轉錄水平。提取皮下脂肪組織中的蛋白，Western blot檢測分析轉錄因子TWIST1和PPARγ蛋白水平。
　　2.脂肪細胞胰島素抵抗模型的建立

3、及鑒定:體外培養3T3-L1脂肪前體細胞，一定方法誘導前體脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞，通過油紅O染色鑒定脂滴。應用高糖/高胰島素誘導法建立脂肪細胞的IR模型，通過葡萄糖消耗實驗、葡萄糖攝取實驗及葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)的免疫細胞化學染色實驗鑒定IR模型。模型建立成功后提取脂肪細胞核蛋白，檢測Twist1和PPARγ在脂肪細胞IR模型中的蛋白表達水平。
　　3.轉錄因子Twist1的表達對胰島素敏感性的影響:慢病毒顆粒轉染3T

4、3-L1成熟脂肪細胞，分別以感染了陰性病毒顆粒NC-LV3和NC-LV5的脂肪細胞為對照，分析干擾和過表達轉錄因子Twist1對脂肪細胞胰島素敏感性的影響。
　　4.轉錄因子Twist1的表達對脂肪細胞中PPARγ表達的影響:慢病毒顆粒轉染3T3-L1成熟脂肪細胞，分別以感染了陰性病毒顆粒NC-LV3和NC-LV5的脂肪細胞為對照，分析干擾和過表達Twist1對PPARγ表達的影響。
　　5.PPARγ表達變化對脂肪細胞中T

5、wist1的影響:PPARγ激動劑吡格列酮(0.1μmmol/L)和抑制劑T0070907(100μmmol/L)作用于誘導分化的成熟脂肪細胞，檢測PPARγ表達變化對Twist1表達的影響。
　　研究結果:
　　1.以對照組皮下脂肪組織中轉錄因子TWIST1和PPARγ轉錄水平為100％，肥胖型IR組脂肪組織中TWIST1和PPARγ的轉錄水平分別下調了41％和28％，具備統計學差異（P＜0.05）。
　　2.以對照

6、組患者的皮下脂肪組織中轉錄因子TWIST1和PPARγ的蛋白水平為100％，肥胖型IR組皮下脂肪組織中的TWIST1和PPARγ表達水平均顯著下調，半定量結果顯示TWIST1和PPARγ蛋白表達水平分別下調了26％和20％，下調水平有統計學差異(P＜0.05)。
　　3.3T3-L1脂肪前體細胞誘導分化為成熟脂肪細胞后，油紅O染色顯示誘導分化成熟的脂肪細胞漿內聚集大量呈橘紅色的脂滴，而未被誘導分化的前體細胞油紅O染色未著色。以胰島

7、素未刺激狀態下葡萄糖消耗和攝取量為100％，對照組細胞的刺激組葡萄糖消耗是未刺激組的2倍，刺激組葡萄糖攝取量是未刺激組的3.1倍，具有統計學差異(P＜0.05)。高糖/高胰島素建立IR模型后，胰島素刺激組葡萄糖消耗是未刺激組的1.1倍，刺激組葡萄糖攝取量是未刺激組的1.3倍，沒有統計學差異(P＞0.05)。但胰島素刺激狀態下的對照組細胞和IR組相比較，IR組細胞的葡萄糖消耗和葡萄糖攝取較對照組下調了46％和59％，存在顯著差異(P＜0.

8、05)。低濃度胰島素刺激建立的胰島素抵抗細胞模型，IR組脂肪細胞膜上的GLUT4免疫熒光強度明顯弱于對照組。提取脂肪細胞核蛋白，Western blot檢測發現在3T3-L1脂肪細胞IR模型組中的轉錄因子Twist1和PPARγ蛋白表達水平是對照組的2.2倍及1.6倍，存在統計學意義(P＜0.05)。
　　4.以感染了陰性病毒顆粒NC-LV3的脂肪細胞為對照，干擾Twist1后其相應蛋白表達水平顯著下調了50％，半定量結果顯示下調

9、水平具有明顯差異(P＜0.05)。慢病毒轉染成熟脂肪細胞后建立IR模型，胰島素作用下的Twist1-/IR組脂肪細胞葡萄糖消耗和葡萄糖攝取分別上調到NC-LV3/IR組的1.5倍和2倍，有統計學差異(P＜0.05)，免疫細胞化學染色也顯示Twist1-/IR組細胞膜上的GLUT4分子數量較NC-LV3/IR組有增加。
　　5.以感染了陰性病毒顆粒NC-LV5的脂肪細胞為對照，過表達Twist1后其蛋白表達水平顯著上調了40％，半定

10、量結果顯示上調程度有統計學意義(P＜0.05)。慢病毒轉染成熟脂肪細胞后建立IR模型，與NC-LV5/IR組細胞相比，胰島素作用后的Twist1+/IR組的葡萄糖消耗和葡萄糖攝取以及細胞膜上GLUT4熒光均無顯著差異，無顯著的統計意義（P＞0.05）。
　　6.分別以感染了陰性病毒顆粒NC-LV3和NC-LV5的脂肪細胞為對照，Twist1-組的3T3-L1成熟脂肪細胞中PPARγ蛋白表達水平較對照組下調36％，半定量分析下調程度

11、有統計學差異(P＜0.05)，Twist1+組PPARγ表達水平上調25％，半定量分析上調程度也有顯著差異（P＜0.05）。
　　7.PPARγ激動劑吡格列酮組與對照組比較，其Twist1蛋白表達水平上調，半定量顯示上調63％，上調程度有統計學差異（P＜0.05），而抑制劑T0070907組相較于對照組，Twist1表達水平顯著下調了77％，半定量分析有明顯差異（P＜0.05）。
　　研究結論:
　　轉錄因子Twist